2025年4月，深圳市第三人民医院/国家感染性疾病临床医学研究中心团队在CRISPR基因编辑技术领域连续取得两项重要成果，相关成果分别发表于国际权威期刊《International Journal of Biological Macromolecules》与《BMC Microbiology》。两项研究聚焦结核杆菌耐药基因高通量检测与核酸诊断技术革新，为传染病精准诊疗及分子诊断工具开发开辟了新路径。
1.突破一：CRISPR-Cas14a平台实现结核杆菌耐药基因高通量检测
全球耐药结核病防控形势严峻，传统表型药敏试验（pDST）耗时长（需数周至数月）、效率低，现有分子检测技术亦存在位点覆盖有限、成本高昂或操作复杂等瓶颈。
该研究开发的 CRISPR-Cas14a MTB RIF/INH 平台，能检测与利福平（RIF）和异烟肼（INH）耐药相关的常见突变。研究人员收集 60 株临床分离株，包括利福平单耐药、异烟肼单耐药、多药耐药及全敏感菌株，同时从疑似结核病患者采集痰样本。经处理后，运用 pDST、PCR 测序等多种方法，对平台性能展开评估。在检测 60 株临床分离株时，该平台检测利福平耐药的敏感度达 93.3%，特异度为 100%；检测异烟肼耐药的敏感度为 97.5%，特异度 100%。在 55 份痰样本检测中，检测利福平耐药的敏感度为 85.7%，特异度 100%；检测异烟肼耐药敏感度达 100%，且与 pDST 结果无差异。并且整个流程排除核酸提取步骤，整个检测过程约 1.5 小时，相比世界卫生组织推荐的多数分子快速诊断技术相比，检测时间大幅缩短，成本也更低。
这一研究成果为耐药结核的快速诊断提供了有力工具，有望推动结核病精准治疗，助力全球结核病防控工作，尤其在资源有限地区，其应用前景广阔，未来随着技术优化，将为临床诊疗带来更多便利和高效的解决方案。
2.突破二：建立非依赖PAM序列的CRISPR-Cas12a核酸检测技术
CRISPR-Cas12a虽为核酸诊断利器，但其反式切割活性对原间隔序列邻近基序（PAM）的依赖性长期制约技术灵活性。传统观点认为，PAM序列是激活Cas12a反式切割的必要条件。本研究通过合成多种PAM序列底物，并采用三种Cas12a同源蛋白开展系统性顺式切割与反式切割实验，发现双链DNA（dsDNA）无需PAM即可激活Cas12a的反式切割活性，且该激活过程独立于顺式切割。值得注意的是，单链RNA（ssRNA）也可直接触发Cas12a的反式切割活性。实验验证了CRISPR-Cas12a检测无PAM靶标dsDNA的可行性，包括临床样本突变位点鉴定。基于AlphaFold 3的结构预测揭示了Cas12a非PAM依赖性反式切割的潜在机制。此项发现颠覆了传统CRISPR技术的PAM依赖性框架，为开发高灵敏度、通用型分子诊断平台奠定理论基础。未来通过优化Cas12a同源蛋白选择并与Cas13a联用，有望实现“单管反应”同步检测DNA与RNA病原体，在结核耐药突变筛查、RNA病毒即时诊断及癌症早筛等领域潜力巨大。
3.双重突破的协同意义
两项成果分别从技术应用与机制创新层面推动CRISPR诊断技术的发展：CRISPR-Cas14a平台直面临床需求，以快速、精准、低成本的优势破解耐药结核诊断难题；CRISPR-Cas12a非PAM依赖性技术打破理论桎梏，为分子诊断工具的通用性与灵敏度升级提供全新范式。二者的结合将加速下一代分子诊断平台的研发，为传染病防控、精准医学及公共卫生体系建设注入强劲动能。
两篇论文的第一作者均为深圳市第三人民医院/国家感染性疾病临床医学研究中心肖国辉博士，肖国辉博士主要致力于基于CRISPR的病原诊断技术研发，先后发表《J Clin Microbiol》、《TALATA》等多篇论文。深圳市第三人民医院/国家感染性疾病临床医学研究中心张国良教授为论文通讯作者。项目得到国家自然科学基金、深圳市科技计划项目、深圳市医疗卫生“三名工程”等项目的支持。
